výzvy při extrakci RNA

Průvodce odstraňováním problémů pro extrakci celkové RNA & Čištění

1. Co způsobuje degradaci RNA?
2. Jak lze zlepšit extrakci RNA?
3. Proč je těžší extrahovat RNA než DNA?
4. Jak můžete zabránit kontaminaci DNA během izolace RNA?
5. Jak můžeme chránit RNA před degradací?
6. Zničí autoklávování RNA?
7. Jak zmrazíte buňky pro extrakci RNA?
8. Jak se zbavíte RNA?
9. Jak funguje extrakce RNA?
10. Proč se při extrakci RNA používá kapalný dusík?
11. Jaký je účel extrakce RNA?
12. Jaký je dobrý výtěžek RNA?

Co způsobuje degradaci RNA?

Existují dva hlavní důvody pro degradaci RNA během analýzy RNA. Za prvé, RNA je svou strukturou inherentně slabší než DNA. ... Díky tomu je RNA chemicky labilnější než DNA. RNA je také náchylnější k degradaci teplem než DNA.

Jak lze zlepšit extrakci RNA?

K dosažení tohoto cíle existují 3 účinné metody:

1. Důkladně homogenizujte vzorky ihned po odběru v chaotropním roztoku pro lýzu buněk (např. Obsahující guanidinium), jako je lyzační pufr dostupný v soupravě PureLink RNA Mini Kit nebo TRIzol Reagent.
2. Flash zmrazit vzorky v kapalném dusíku.

Proč je těžší extrahovat RNA než DNA?

Hlavním důvodem je, že RNA je ve srovnání s DNA méně stabilní a snáze se rozkládá. ... RNA má větší rýhy než DNA, což usnadňuje napadení enzymy. Enzymy, které degradují RNA, ribonukleázy (RNasy), jsou v prostředí hojné a je těžké je úplně odstranit.

Jak můžete zabránit kontaminaci DNA během izolace RNA?

Tomuto problému lze někdy zabránit omezením primerů překlenujících hranice intronu, což je však často obtížné a metody, které se v současné době používají ke snížení kontaminace DNA, zahrnují digesci DNAse I, frakcionaci gelem, extrakci kyselým fenolem: chloroformem a srážení chloridem lithným.

Jak můžeme chránit RNA před degradací?

Aby se zabránilo degradaci, vzorky RNA se obvykle skladují zmrazené při -20 ° C nebo -80 ° C nebo pod kapalným dusíkem.

Zničí autoklávování RNA?

Nezapomeňte oddělit reagenty používané pro práci RNA od „reagencií pro obecné použití“ v laboratoři. Všechny roztoky, kromě pufrů Tris, by měly být ošetřeny 0,1% DEPC (nebo DMPC) přes noc při pokojové teplotě a poté autoklávovány. Autoklávování hydrolyzuje a ničí nezreagované DEPC a DMPC.

Jak zmrazíte buňky pro extrakci RNA?

Umístěte tkáň do 1,5 ml zkumavky na mikroodstředivku nebo do 15 ml kónické a zmrazte na suchém ledu. Případně zabalte tkáň do hliníkové fólie a zmrazte ji kapalným dusíkem.

Jak se zbavíte RNA?

Kontaminaci RNA lze odstranit přidáním 2 mikrolitrů RNázy A (10 mg / ml, Fermentas) do 20 mikrolitrů DNA rozpuštěné v TE pufru (Tris – EDTA, pH = 8,0) a inkubovat 3–4 h při 37 ° C.

Jak funguje extrakce RNA?

Metody organické extrakce

Během centrifugace se vzorek dělí na tři fáze: dolní organická fáze, střední fáze, která obsahuje denaturované proteiny a gDNA, a horní vodná fáze, která obsahuje RNA. Horní vodná fáze se izoluje a RNA se oddělí srážením a rehydratací alkoholem.

Proč se při extrakci RNA používá kapalný dusík?

Používá se kapalný dusík, protože má velmi nízkou teplotu -176 ° C, která pomáhá rozmělnit tvrdou látku rostlinné a zvířecí tkáně na prach. Pomáhá také při deaktivaci DNAázy k trávení DNA .

Jaký je účel extrakce RNA?

Extrakce RNA je čištění RNA z biologických vzorků. Tento postup komplikuje všudypřítomná přítomnost ribonukleázových enzymů v buňkách a tkáních, které mohou rychle degradovat RNA.

Jaký je dobrý výtěžek RNA?

A₂₆₀/A₂₈₀ poměr vyšší než 1,8 je obvykle považován za přijatelný indikátor kvalitní RNA s nízkou úrovní kontaminace proteinem [14, 15]. A₂₆₀/A₂₃₀ poměr vyšší než 1,8 se používá jako indikátor extrahované RNA s nízkou úrovní kontaminace polysacharidy.