Jak vyrobit stabilní transfektovanou buněčnou linii

Zajistěte, aby po přenosu byla na jamku přítomna pouze jedna buňka.

1. Krok 1: Transfektujte buňky. Transfekujte buňky pomocí požadované metody transfekce. ...
2. Krok 2: Pasážujte buňky antibiotikem. ...
3. Krok 3: Monitorování buněčných „ostrovů“ ...
4. Krok 4: Izolujte kolonie. ...
5. Krok 5: Přeneste jednotlivé buňky.

1. Jak zajistíte stabilní buněčnou linii?
2. Jak si vyberete kolonie pro stabilní buněčné linie?
3. Co jsou stabilní buněčné linie?
4. Jak vytvoříte buněčnou linii?
5. Kde se nacházejí stabilní buňky?
6. Jak vybíráte transfektovanou buňku?
7. Jaký je význam buněčných linií?
8. Jaký je rozdíl mezi stabilní a přechodnou transfekcí?
9. Jak používáte klonový válec?
10. Co je stabilní genová exprese?
11. Může se regenerovat stabilní buňky?
12. Co je to permanentní buňka?

Jak zajistíte stabilní buněčnou linii?

Protokol pro generování stabilních buněčných linií vyžaduje několik kroků, jak je uvedeno níže:

1. Vytvořte smrtící křivku pro stanovení optimální koncentrace antibiotika pro výběr.
2. Transfektujte buňky požadovaným plazmidovým konstruktem (konstrukty)
3. Vyberte a rozbalte stabilní polyklonální kolonie.
4. Identifikujte jednotlivé klony omezeným ředěním a expanzí.

Jak si vyberete kolonie pro stabilní buněčné linie?

Chcete-li odebrat kolonie, připravte 24jamkové misky s 1 ml média obsahujícího G418 v každé jamce. Opláchněte misku PBS a poté přidejte teplý PBS obsahující 5% trypsinu (1 ml standardního trypsinu-EDTA plus 19 ml PBS).

Co jsou stabilní buněčné linie?

Generování stabilní buněčné linie se týká procesu vývoje homogenních populací buněk, které prokazují expresi transfektovaného genového inzertu. ... To je opak přechodných transfektovaných buněk, které exprimují transfektovanou DNA na krátkou dobu (např. 8 až 96 hodin).

Jak vytvoříte buněčnou linii?

Nejjednodušší způsob, jak vytvořit novou buněčnou linii, je upravit existující linii, což je společná strategie, když se zavedená linka již blíží splnění požadavků. Z těchto modifikací často pocházejí buňky optimalizované pro růst konkrétních virů nebo pro maximalizaci produkce rekombinantního proteinu.

Kde se nacházejí stabilní buňky?

V buněčné biologii jsou stabilní buňky buňky, které se množí pouze v případě potřeby. Většinu času tráví v klidném G₀ fáze buněčného cyklu, ale může být stimulován, aby v případě potřeby vstoupil do buněčného cyklu. Mezi příklady patří játra, proximální tubuly ledvin a žlázy s vnitřní sekrecí.

Jak vybíráte transfektovanou buňku?

Jedním z nejspolehlivějších způsobů výběru buněk, které stabilně exprimují transfekovanou DNA, je zahrnutí selektovatelného markeru do konstruktu DNA použitého pro transfekci nebo do samostatného vektoru, který je kotransfekován do buňky, a poté aplikujte vhodný selektivní tlak na buňky po krátké době zotavení.

Jaký je význam buněčných linií?

Buněčná linie je obecný termín, který se vztahuje na definovanou populaci buněk, kterou lze udržovat v kultuře po delší dobu, přičemž si zachovává stabilitu určitých fenotypů a funkcí. Buněčné linie jsou obvykle klonální, což znamená, že celá populace pocházela z jedné společné buňky předků.

Jaký je rozdíl mezi stabilní a přechodnou transfekcí?

Při stabilní transfekci se plazmidová DNA úspěšně integruje do buněčného genomu a bude předána dalším generacím buňky. Při přechodné transfekci však transfektovaný materiál vstupuje do buňky, ale neintegruje se do buněčného genomu.

Jak používáte klonový válec?

Pomocí sterilních středních kleští zvedněte klonovací válec. Jemně vtlačte ploché dno válce do hladkého silikonového maziva a odstraňte ho náhlým svislým pohybem. Pokud je provedeno správně, dojde k rovnoměrnému rozložení tuku na dně válce. Umístěte válec na kolonii.

Co je stabilní genová exprese?

Exprese cizího genetického kódu je kontinuální a postup transfekce se nazývá stabilní transfekce. Pokud hostitelská buňka odmítne vložený segment DNA, transfekce se stane přechodnou, protože exprese zavedeného genetického materiálu je s následujícími generacemi ztracena..

Může se regenerovat stabilní buňky?

Labilní buňky (1), jako je dlaždicový epitel kůže, se neustále dělí a regenerují. Trvalé buňky (2), jako jsou neurony, nejsou schopné proliferovat a opustit buněčný cyklus. Stabilní buňky (3), jako jsou jaterní hepatocyty, mají nízkou úroveň replikace a mohou se regenerovat, když jsou signalizovány.

Co je to permanentní buňka?

Trvalé buňky jsou definovány jako buňky, které nejsou schopny replikace v postnatálním životě. Nervové buňky, také nazývané neurony, spolu s kosterním svalem a srdečními buňkami, jsou zahrnuty do této skupiny, která tradičně identifikuje lidské tkáně, které nejsou schopné spontánní regenerace.